Biochemical and immunological characterization of beef liver NADPH-cytochrome P450 reductase
Sığır karaciğer NADPH-sitokrom P450 redüktaz enziminin biyokimyasal ve immünolojik karakterizasyonu
- Tez No: 118981
- Danışmanlar: PROF. DR. EMEL ARINÇ
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyokimya, Biochemistry
- Anahtar Kelimeler: Sitokrom P450 redüktaz, sığır karaciğeri, koyun akciğeri, sitokrom P4502B, kinetic, antikorlar, monooksijenazlar vı, Alerji ve immünoloji, Enzimler, Karaciğer, Koyunlar, Redüktaz, Sitokromlar, Sığırlar, Cytochrome P450 reductase, beef liver, sheep lung, cytochrome P4502B, kinetics, antibodies, monooxygenases iv, Allergy and immunology, Enzymes, Liver, Sheep, Reductase, Cytochroms, Cattles
- Yıl: 2002
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyokimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
öz SIĞIR KARACİĞER NADPH-SİTOKROM P450 REDÜKTAZ ENZİMİNİN BİYOKİMYASAL VE İMMÜNOLOJİK KARAKTERİZASYONU ÇELİK, Haydar Yüksek Lisans, Biyokimya Bölümü Tez Yöneticisi: Prof. Dr. Emel ARINÇ Ocak 2002, 136 sayfa NADPH bağımlı sitokrom P450 redüktazın bazı anti-kanser ilaçların, antibiyotiklerin redükleyici metabolizmasında, hatta lipid peroksidasyonunda ve genotoksisite ve sitotoksisite ile sonuçlanan reaktif oksijen türlerinin üretilmesinde önemli rol oynadığı bilinmektedir. Bu enzim aynı zamanda, NADPH den sitokrom P450 ye indirgeyici değerlikleri transfer ettiği sitokrom P450 bağımlı oksidatif ilaç metabolizması yapan enzim sisteminin vazgeçilmez bir bileşenidir. Bu çalışmada, ilk defa, sığır karaciğerinden saflaştirılan amfipatik NADPH- sitokrom P450 redüktazın biyokatalitik, yapısal ve immünolojik özellikleri karakterize edildi. Enzim 239 kez saflaştırıldı ve sığır karaciğer mikrozomlarına oranla verim 13.5% di. Saflaştırma procedürü deterjan ile çözünürleştirilmiş mikrozomların DEAE-selüloz kolonunda iyon değişim kromatografisini gerektirdi. Sığır redüktazının daha da saflaştırılması ve konsantre edilmesi ikinci DEAE kolonu ve bunu takiben 2',5'-ADP Sefaroz affinite kromatografisi ile yapıldı. Son olarak, iyonik olmayan Emulgen 913 deterjanını uzaklaştırmak ve enzimi daha da konsantre etmek için hidroksilapatit kolon kromatografisi yapıldı. Enzimin saflaştırılmasıaşamasında değişik problemler ile karşılaşıldı. Enzim NADP+/NADPH bağımlı redüktazların saflaştırılması için kullanılan her zamanki pH 7.6 değerinde 2',5'-ADP Sefaroz 4B affinite kolonuna bağlandırılamadı. Sığır redöktazının affinite kolonuna bağlanması pH 7.1 de başarıldı. Enzimin SDS-poliakrilamit jel elektroforezi ile monomer moleküler ağırlığı 76000±3000 (N=5) olarak bulundu. Sığır redüktazının absorbans spektrumu flavoproteinlerin karakteristiği olan 478 nm de çıkmtı ile 455 ve 378 nm lerinde iki tepecik gösterdi. Sitokrom c konsantrasyonu, pH, reaksiyon sıcaklığı, ve iyonik kuvvetin enzim aktivitesine olan etkileri çalışıldı. Sitokrom c nin enzimle olan reaksiyonu Michaelis-Menten kinetiğini takip etti, ve saflaştınlan enzimin görünen Km değeri sitokrom c için, enzim aktivitesi 0.3 M potasyumfosfat tamponu, pH 7.7 de ölçüldüğünde, 47.66 uM olarak bulundu. Sitokrom c redüktaz aktivitesinin sitabilitesi 20% lik giliserol varlığında ve yokluğunda 25°C ve 37°C de incelendi. Giliserolün varlığımn her iki sıcaklıktada sitokrom c redüktaz aktivitesinin sitabilitesini artırdığı gözlemlendi. Koyun akciğer mikrozomal P4502B ve NADPH-sitokrom 450 redüktaz, laboratuvanmızda geliştirilen zaten varolan metodlarla saflaştırıldı. Saf koyun akciğer sitokrom P450 redüktazına karşı tavşanda antikorlar üretildi. Koyun akciğer sitokrom P4502B si, sığır sitokrom P450 redüktazının biyokatalitik aktivitesinin tayininde kullanıldı. Her iki sığır karaciğer ve koyun akciğer redüktazlan, koyun akciğer sitokrom P4502B ve sentetik lipid, fosfatidil dilaurolkolin, içeren yeniden oluşturulmuş sistemde, benzfetamin ve kokain N-demetilasyonunu hemen hemen eşit olarak destekledi. Sığır karaciğer sitokrom P450 redüktazının koyun akciğer sitokrom P450 redüktazına immünolojik olarak benzerlik gösterdiği bulundu. Bu, Western-blot, sığır karaciğer ve koyun akciğer mikrozomlarındaki sitokrom c redüktaz aktivitesinin ve yeniden oluşturulmuş sistemlerdeki benzfetamin N- demetilasyon aktivitesinin antikor inhibisyonu çalışmaları ile doğrulandı.
Özet (Çeviri)
ABSTRACT BIOCHEMICAL AND IMMUNOLOGICAL CHARACTERIZATION OF BEEF LIVER NADPH-CYTOCHROME P450 REDUCTASE ÇELİK, Haydar M.S., Department of Biochemistry Supervisor: Prof. Dr. Emel ARJNÇ January 2002, 136 pages NADPH dependent cytochrome P450 reductase is known to play important roles in the reductive metabolism of some anti-cancer drugs, antibiotics, as well as in lipid peroxidation and in the production of reactive oxygen species which results in genotoxicity and cytotoxicity. It is also obligatory component of the cytochrome P450 dependent oxidative drug metabolizing enzyme system, where it transfers reducing equivalents from NADPH to cytochrome P450. In this study, for the first time, biocatalytic, structural, and immunological properties of amphipathic NADPH-cytochrome P450 reductase purified from beef liver were characterized. The enzyme was purified 239-fold and the yield was 13.5% with respect to beef liver microsomes. The purification procedure involved the ion- exchange chromatography of the detergent solubilized microsomes on DEAE- cellulose column. Further purification and concentration of beef reductase was carried out with a second DEAE-cellulose column followed by the 2',5'-ADP Sepharose chromatography. Finally, hydroxylapatite column chromatography was performed to remove the non-ionic detergent Emulgen 913 and to further concentrate mthe enzyme. During the purification of the enzyme, several problems had been encountered. Enzyme was not bound to 2'-5'-ADP-Sepharose affinity column at pH 7.6, the usual pH used for the purification of NADP+/NADPH dependent reductases. Binding of the beef reductase to the affinity column was accomplished exclusively at pH 7.1. Monomer molecular weight of the enzyme was estimated to be 76000 ±3000 (N=5) by SDS-PAGE. The absolute absorption spectrum of beef reductase showed two peaks at 455 nm and 378 nm, with a shoulder at 478 nm, characteristics of flavoproteins. The effects of cytochrome c concentration, pH, reaction temperature and ionic strength on the enzyme activity were studied. Reduction of cytochrome c with the enzyme followed Michaelis-Menten kinetics, and the apparent Km of the purified enzyme was found to be 47.66 uM for cytochrome c when the enzyme activity was measured in 0.3 M potassium phosphate buffer, pH 7.7. Stability of cytochrome c reductase activity was examined at 25 °C and 37°C in the presence and absence of 20% glycerol. The presence of glycerol enhanced the stability of cytochrome c reductase activity at both temperatures. Sheep lung microsomal cytochrome P4502B and NADPH-cytochrome P450 reductase were also purified by the already existing methods developed in our laboratory. Antibodies were produced in rabbit against pure sheep lung cytochrome P450 reductase. The purified sheep lung cytochrome P4502B was used in the assessment of monooxygenase activities of beef cytochrome P450 reductase. Both beef liver and sheep lung reductases almost equally supported N-demethylation of benzphetamine and cocaine in a reconstituted system containing purified sheep lung cytochrome P4502B and synthetic lipid, phosphatidylcholine dilauroyl. Beef liver cytochrome P450 reductase was found to be immunologically similar to sheep lung cytochrome P450 reductase. This is supported by Western-blot analysis, antibody inhibition studies of both cytochrome c reductase activity in beef liver and sheep lung microsomes and benzphetamine N-demethylation activity in the reconstituted systems.
Benzer Tezler
- Cytochrome P4502B-type protein from feral leaping mullet (liza saliens) liver microsomes: Its isolation and biochemical and immunological characterization
Doğal kefal balığı (marvaki) karaciğerinden sitokrom P4502B-tipi protein: Saflaştırılması, biyokimyasal ve immunolojik karakterizasyonu
AZRA BOZCAARMUTLU
Doktora
İngilizce
2002
BiyokimyaOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
PROF.DR. EMEL ARINÇ
- Total parenteral nütrisyon alan çocuklarda, üç farklı lipid emülsiyonunun klinik, biyokimyasal ve immunolojik etkilerinin karşılaştırılması
The comparison of the clinical, biochemical and immunological effects of three lipid emulsions in children receiving total parenteral nutrition
SALİH ÇAĞRI ÇAKIR
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2005
Çocuk Sağlığı ve HastalıklarıUludağ ÜniversitesiÇocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı
PROF. DR. TANJU MUNEVVER ÖZKAN
- Gastrointestinal sistem kanserli hastalarda ameliyat öncesi ve sonrası farklı enteral beslenme desteğinin antropometrik biyokimyasal ölçümlere ve immünolojik fonksiyonlarına etkisi üzerine bir araştırma
A Study on the effect of different enteral nutrition supplements on the anthropometric and biochemical meaurements, and immunological functions on the preoperative and postoperative patients with gastrointestinal ...
NİHAL ZEKİYE ERDEM
Doktora
Türkçe
1998
Beslenme ve DiyetetikHacettepe ÜniversitesiBeslenme ve Diyetetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NAZAN BOZKURT
- Behçet hastalarında damar tutulumu ve koagülasyon parametrelerinin değerlendirilmesi
Başlık çevirisi yok
ECE HARMAN
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2005
RomatolojiYüzüncü Yıl Üniversitesiİç Hastalıkları Ana Bilim Dalı
DOÇ.DR. MEHMET SAYARLIOĞLU
- Seminal sıvı ve artıklarında p30 antijeni ve spermatozoa saptanmasına yönelik yöntem çalışmaları
Başlık çevirisi yok
MEHMET HAKAN ÖZDEMİR