Geri Dön

Gen kontrol bölgelerinde yönlendirilmiş mutagenez ile yapılacak değişikliklerin ekspresyon üzerine etkilerinin penisilin asilaz (PA) modelinde incelenmesi ve ilgili klonda ekspresyonun gerçekleştiği promotorun belirlenmesi

The investigation of the effects of the modifications introduced by site-directed mutagenesis on the gene kontrol region on the penicillin acylase (PA) model system and determination of the promotor from which gene expression directed

  1. Tez No: 111904
  2. Yazar: SALİHA İŞSEVER ÖZTÜRK
  3. Danışmanlar: PROF.DR. ENGİN BERMEK
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyofizik, Biophysics
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2002
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: İstanbul Üniversitesi
  10. Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyofizik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

ÖZET Penisilin G'yi 6-APA ve PAA'ya hidroliz eden penisilin asilaz enzimi, bu ürünlerden 6-APA yan-sentetik penisilinlerin sentezinde başlangıç maddesi olarak kullanıldığından, endüstriyel olarak önemli bir enzimdir. Aktif enzim sitoplazmada sentezlenen öncül bir molekülün periplazmaya taşınmasını izleyen proteolitik bir süreç ile oluşur. Penisilin asilazın rDNA teknolojileri kullanılarak etkin şekilde üretilmesi, geninin büyüklüğü, sentezinin sıcaklık duyarlılığı ve PA öncülünün periplazmaya taşındıktan sonra prokaryotlarda ender olarak gözlenen bir süreçte aktive olması nedeniyle güçtür. Penisilin asilazın sentezinden sorumlu pac geni, TÜBİTAK GMBAE Enzim Moleküler Genetiği Grubu tarafından, £ co//'ATCC11105 soyundan klonlanmış ve aktif enzim konstitütif olarak eksprese edilmiştir. Geliştirilen pac3.5-pUC19 JM109 rekombinant soyunda pac geninin lac promotorunun önüne kanlanmasına karşın, ekspresyon, bu promotorun kimyasal uyarıcısı olan IPTG ile yapılan çalışmaların ancak bir bölümünde uyanlabilmiştir. Bu bulgular, pac geni ekspresyonunun lac promotorundan çok kendisine özgü bir promotordan yönetilebileceğini düşündürmüştür. Bu çalışmada Öncelikle, ilgili klonda pac geni ekpresyonunun pac ve lac promotorlarından hangisinden kaynaklandığının saptanması, daha sonra SD ve ATG başlama kodonu arasındaki uzaklığın ve baz içeriğinin değiştirilmesi ile ekspresyon etkinliğinin iyileştirilmesi amaçlanmıştır. Çalışmada, mutasyonlann oluşturulması için uygun oligonükleotitler ve PCR aracılığı ile gerçekleştirilen yönlendirilmiş mutagenez yöntemi kullanılmıştır. Elde edilen bir promoter mutantı ve SD/ATG aralığı değiştirilmiş pac mutantı ile, yaban tipi geni taşıyan rekombinant soya görece daha yüksek bir enzim aktivitesi elde edilmiştir. Bulgular, gen ekspresyonunun pac ve/veya lac promotoru tarafından yönetilebileceğini göstermiştir. Çalışma kapsamında geliştirilen ve SD/ATG aralığındaki mutasyonu promoter mutasyonu ile birarada taşıyan rekombinant soy ile artan bir gen ekspresyonu ve enzim aktivitesi elde edilmiştir. SO/ATG mutasyonu taşıyan klonlar ile 37°C'ta, 28°C'ta elde edilen değerler ile karşılaştırılabilecek düzeyde aktif enzim elde edilmiştir. 147

Özet (Çeviri)

ABSTRACT The Investigation of the Effects of the Modifications Introduced by Site-Directed Mutagenesis on the Gene Control Region in the Penicillin Acylase (PA) Model System and Determination of the Promoter from which Gene Expression Directed PA hydrolyzing penicillin G to 6-APA and PAA, is an industrially important enzyme since one of its products (6-APA) is used as a raw material for the production of semi-synthetic penicillins. The active enzyme is formed by proteolytic processing of a precursor synthesized in the cytoplasm, following its translocation into the periplasm. The efficient production of the PA by using rDNA technologies is difficult because of the size of pac gene, the temperature-sensitivity of the PA synthesis and activation of the precursor by a proteolytic processing, which is usual for prokaryotic proteins, following ite translocation into the periplasm. The pac gene which is responsible for the synthesis of PA, has been cloned from E. coll ATCC 11105 by the Enzyme Molecular Genetics Group in RJGEB-TÛBtTAK and the active enzyme has been expressed constitutively. Although the pac gene was cloned downstream of lac promoter in the developed recombinant strain pac3.5-pUC19 £ coli JM109, the gene expression could be induced by IPTG only in some of the experiments. This evidence suggested the expression of the pac gene could be directed by its own promoter rather than the lac promoter. The aim of the present study, was first the determination of the promoter from which pac gene expression was originated and then improvement of the expression efficiency through the changement of the distance and base content between SD motive and AUG start codon. To introduce the mutations, the SDM method based on PCR and appropriate oligonucleotides has been used. The higher levels of the enzyme activity were obtained with one of the promoter mutants and other mutant containing the modification in the space between SD and AUG, compairing to the rocombinant strain containing the wild type pac gene. The evidence indicated that the expression of the pac gene could be directed by pac and/or lac promoter. In the scope of the present study, an increased gene expression and enzyme activity were obtained with the developed recombinant strain containing both of the promoter mutation and modification in the space between SD-AUG. Active enzyme levels reached at 37°C, with the clones containing SO-AUG mutations, were comparable to the enzyme activity obtained at 28°C growing temperature. 148

Benzer Tezler

  1. Tez No

    129441

    Investigations to elucidate the molecular mechanisms controlling transcription of the factor VIII and von Willebrand genes

    Faktör VIII ve von Willebrand faktör genlerinin transkripsiyonunu kontrol eden moleküler mekanizmalarının ortaya çıkarılmasına yönelik araştırmalar

    ERGÜL BERBER

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2002

    Tıbbi BiyolojiBoğaziçi Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. S. HANDE ÇAĞLAYAN

  2. Tez No

    88535

    İdiyopatik hipogonadotropik hipogonadizmli erkeklerde vitamin D reseptör gen likusundaki polimorfizm ile kemik mineral yoğunluğu arasındaki ilişki

    Başlık çevirisi yok

    GÖKHAN ÖZIŞIK

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    1999

    Endokrinoloji ve Metabolizma HastalıklarıGata

    İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. METİN ÖZATA

  3. Tez No

    114147

    Bazı buğday (Triticum spp. )çeşitlerinin alüminyuma karşı toleranslarının araştırılması

    Aluminium tolerance research on some wheat (Triticum spp. ) varieties

    TÜRKAN ÖZAYDIN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2001

    BiyolojiEge Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. İSMAİL TÜRKAN

  4. Tez No

    123824

    Lokalize erken başlangıç Periodontitis'li Türk hastalarda vitamin D reseptör (VDR) geni Apa I ve Taq I polimorfizimlerinin görülme sıklığı

    Association of vitamin D receptor gene polymorphisms with Apa I and taq I in localized early-onset peirodontal diseases

    MELDA MISIRLIOĞLU

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2002

    Diş HekimliğiAnkara Üniversitesi

    Oral Diagnoz ve Radyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF.DR. SEBAHAT GÖRGÜN

  5. Tez No

    91943

    Effects of paratyroid hormone in mice with genetic ablation of c-fos

    Paratiroid hormonun genetik olarak c-fos mutasyonuna sahip farelerdeki etkileri

    BURAK DEMİRALP

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2000

    Diş HekimliğiHacettepe Üniversitesi

    Periodontoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. KENAN ERATALAY

    DOÇ. DR. LAURİE K. MCCAULEY

Geri Dön